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非洲豬瘟的病原、流行病學、癥狀、診斷、疫苗、綜合防控

  摘 要:

  非洲豬瘟 (African Swine Fever, ASF) 是由非洲豬瘟病毒 (African Swine Fever Virus, ASFV) 引起的一種急性、烈性、高度接觸性傳染病, 嚴重危害著全球養豬業。2007年以來, 非洲豬瘟在全球多個國家發生、擴散、流行, 特別是俄羅斯及其周邊地區, 給我國養豬業帶來了嚴重威脅。因此, 為切實做好非洲豬瘟疫情防范工作, 本文從病原學、流行病學、臨床及實驗室診斷、風險因素、綜合防控等各個方面對其進行綜述, 加強人民對非洲豬瘟的認識, 增強各豬場及進出口岸對非洲豬瘟的檢疫防范意識, 加大檢驗力度, 為防止非洲豬瘟傳入我國打下基礎。

  關鍵詞:

  非洲豬瘟; 流行病學; 診斷; 風險因素; 綜合防控;

  非洲豬瘟 (ASF) 是由非洲豬瘟病毒 (ASFV) 引起的一種急性、烈性、高度接觸性的傳染病, 其發病率高, 死亡率可高達100%, 世界動物衛生組織 (OIE) 將其列為必須報告動物疫病, 我國將其列為一類動物疫病。該病最早在1921年于非洲的肯尼亞國家確認發生, 2007年以來, 非洲豬瘟在全球多個國家發生、擴散、流行, 特別是俄羅斯及其周邊地區。2017年3月, 俄羅斯遠東地區伊爾庫茨克州發生非洲豬瘟疫情, 疫情發生地距離我國較近, 僅為1000km左右;另外, 我國是養豬及豬肉消費大國, 生豬出欄量、存欄量以及豬肉消費量均位于全球首位, 每年種豬及豬肉制品進口總量巨大, 與多個國家貿易頻繁;而且, 我國與其它國家的旅客往來頻繁, 旅客攜帶的商品數量多、種類雜。因此, 非洲豬瘟傳入我國的風險日益加大, 一旦傳入, 其帶來的直接以及間接損失將不可估量。對此, 2017年4月12日, 我國農業部發布了關于進一步加強非洲豬瘟風險防范工作的緊急通知。

  為切實做好非洲豬瘟疫情防范工作, 本文從非洲豬瘟的病原學、流行病學、臨床及實驗室診斷、風險因素、綜合防控等各個方面進行綜述, 以期加強人民對非洲豬瘟的認識, 增強各豬場及進出口岸對非洲豬瘟的檢疫防范意識, 加大各部門的檢驗力度, 為防止非洲豬瘟傳入我國打下基礎。

  1 病原學

  1.1 分類及形態結構

  2005年7月, 國際病毒分類委員會 (ICTV) 最新病毒分類第八次報告中指出, 非洲豬瘟病毒屬于DNA病毒目, 非洲豬瘟病毒科, 非洲豬瘟病毒屬成員, 是一種具有20面體結構, 直徑為175~215nm, 基因組全長170~190kb, 含有151個開放閱讀框, 可編碼150~200種蛋白, 具有囊膜的雙股線性DNA病毒。非洲豬瘟病毒是由病毒基因組、完成基因早期轉錄所必須的酶以及一些DNA結合蛋白組成, 結構蛋白較多, 其中p72是主要的結構蛋白之一, 占病毒總蛋白量的1/3, 而且該蛋白序列保守, 抗原性佳, 病毒感染后能夠產生高滴度的抗p72抗體, 因此常被用作非洲豬瘟的血清學診斷;另外, 根據p72基因末端一段478bp的核酸序列, 非洲豬瘟可分為23個基因型, 如Benin97/1為基因I型, Malawi Li20/1為基因VIII型, 東非埃塞爾比亞分離株屬于基因XXIII型。非洲豬瘟病毒基因組變異頻繁, 表現出明顯的遺傳多樣性。非洲豬瘟病毒不能夠誘導產生中和抗體, 因此還沒有對血清型進行分類。

  1.2 理化特性

  非洲豬瘟病毒粒子在Percoll細胞分離液和氯化銫中的浮密度分別為1.095g/cm3和1.19~1.24g/cm3。該病毒為囊膜病毒, 能夠抵抗蛋白酶的作用, 對乙醚及氯仿等脂溶劑敏感, 但易被胰酶滅活。病毒在p H 4~10的溶液中比較穩定, 但對溫度非常敏感, 病毒可在5℃的血清中存活6年, 56℃加熱70min或60℃加熱30min可使其滅活。

  1.3 體外生長特性

  非洲豬瘟病毒體內感染的主要細胞類型為單核-巨噬細胞系統, 包括組織巨噬細胞和網狀內皮細胞, 也能在雞胚卵黃囊和骨髓細胞中增殖。在體外, 用于病毒分離培養的細胞分2類:一類為原代細胞, 主要為單核-巨噬細胞, 接種48h后, 細胞圓縮腫大, 隨后脫落、溶解;另一類為傳代細胞系, 比如豬腎細胞系 (PK) 、乳倉鼠腎細胞 (BHK-21) 、非洲綠猴腎細胞 (Vero) 以及豬睪丸細胞 (ST) 等, 但傳代細胞對野毒株較不敏感。一些分離株已適應傳代細胞系, 并可以產生細胞病變。

  1.4 不同環境下的存活狀態

  非洲豬瘟病毒在環境中比較穩定, 能夠在污染的環境中保持感染性超過3d, 在豬的糞便中感染能力可持續數周, 在死亡野豬尸體中可以存活長達1年;病毒在肉制食品中亦比較穩定, 冰凍肉中可存活數年, 半熟肉以及泔水可長時間存活, 腌制火腿中可存活數月, 未經燒煮或高溫煙熏的火腿和香腸中能存活3~6個月, 4℃保存的帶骨肉中至少存活5個月。

  1.5、分子病原學

  1.5.1、 病毒基因組結構

  ASFV是一種單分子線狀雙鏈DNA病毒, 屬于雙鏈DNA病毒目, 非洲豬瘟病毒科, 非洲豬瘟病毒屬, 也是ASFV家族中的唯一成員。病毒基因組末端以共價鍵閉合, 長度170~190kb, 含有151個開放性閱讀框 (ORFs) , 可以編碼150~200種蛋白質[2-3]。基因組中央是長約125kb的保守區, 左端48kb和右端22kb中間區域存在差異, 這也是不同分離株的基因組長度存在差異的主要原因[4]。采用限制性內切酶進行酶切圖譜分析表明, 分離于美洲和歐洲的病毒株為同一個基因型, 而分離于非洲的毒株則具有多種基因型, 這進一步說明來自不同區域的毒株之間存在較大的基因型差異, 以及來自非洲以外地域的ASFV可能有著共同的起源。組織細胞適應株 (西班牙BA71V分離株) 是第一個被確定基因組全序列的毒株, 該毒株常作為實驗室研究的重要對象[2]。目前, 11株ASFV全基因組序列已被測定, 其中1株為無毒力的西班牙BA71V分離株, 1株為有毒力的西班牙E75分離株, 1株低毒力毒株分離于葡萄牙軟蜱體內, 剩余8株分離于非洲家豬或野豬體內[3]。

  1.5.2、病毒形態結構特征

  ASFV是一種正二十面體對稱結構病毒, 病毒直徑200nm, 其中直徑為70~100nm的DNA核心位于病毒中間, 直徑為172~191nm的二十面體衣殼和含類脂的囊膜包裹著病毒外周。衣殼呈二十面體對稱, 由1 892~2 172個殼粒構成, 中心有孔, 呈六棱鏡狀, 殼粒間的間距為7.4~8.1nm[5]。成熟的病毒粒子由多層結構組成, 約含有50多種病毒編碼蛋白質, 其中包括結構蛋白、基因轉錄和RNA加工所需的酶, 這些蛋白是構成病毒粒子結構的主要成分, 對病毒粒子的再次感染有著重要作用[6]。ASFV病毒粒子的形成發生于細胞核周圍的“病毒加工廠”區域, 在病毒粒子形成的最初階段, P72結構蛋白從細胞質中富集并與內質網膜結合, 然后在膜凸起的表面上形成衣殼, 在凹進的表面上形成衣殼心;在病毒裝配階段, 首先被病毒蛋白修飾后的內質網膜作為病毒粒子內膜, 隨后P72蛋白被裝配到病毒粒子之中, 同時多聚蛋白P220被酰基化后連接到未成熟的病毒粒子衣殼內膜, 接著病毒晚期結構蛋白P49得到表達, 形成二十面體病毒粒子。下一步是多聚蛋白P220和P62經S273R酶分解加工形成病毒核衣殼和有感染性的病毒粒子, 最后病毒粒子二十面體閉合, 病毒DNA嵌入及核心蛋白濃縮, 最終形成成熟的病毒粒子[7]。

  構成病毒粒子的結構蛋白有P72, P49, P54, P220, P62, CD2v蛋白等, 其中P72蛋白表達于AS-FV感染晚期, 位于病毒衣殼的表面, 具有良好的反應原性和抗原性, 是病毒二十面體衣殼的重要組成成分, 參與病毒吸附過程以及病毒裝配過程中P220和P62的加工, 除此, P72編碼基因具有較高的同源性, 常用于ASFV基因的分型[8-10]。P54蛋白位于病毒顆粒類脂外膜上, 由病毒E183L基因編碼, P54的差異表達可能會出現在細胞傳代過程中;研究發現在該蛋白氨基末端含有跨膜區域, 因此P54蛋白在病毒感染過程中發揮重要作用, 尤其在病毒蛋白經內質網膜轉化成病毒包膜前體時發揮著非常重要的作用[11]。P54蛋白含有一個LC8動力蛋白結合結構域, 可與8 000的輕鏈細胞質動力蛋白DLC8發生交叉反應, 并在病毒內化以及將病毒運輸到復制區的過程中起著重要作用[12]。P220和P62為2種多聚蛋白前體, 是病毒感染的晚期蛋白, 經S273R酶加工成P150, P37, P34, P14, P35和P15蛋白, 這6種結構蛋白位于成熟的病毒粒子的核衣殼之中, 在病毒衣殼的裝配過程中起著重要作用;研究發現P220和P62的正常加工是病毒粒子成熟的一個重要指標[13-14]。除此, 病毒粒子中還包含一些逃避宿主防御系統的蛋白, A238L是重要的免疫調節蛋白, 該病毒蛋白與細胞IkB蛋白具有同源性, 可以抑制機體NFkB轉錄因子和鈣調磷蛋白磷酸酶的活性。CD2v與T細胞表面黏附因子CD2具有相似性, 其能使病毒顆粒吸附于紅細胞表面, 同時該蛋白可以損壞淋巴細胞的功能;研究發現, CD2v的表達影響ASFV在家豬間的傳播[15-16]。

  2 流行病學

  2.1 傳染源

  豬是非洲豬瘟病毒唯一的自然宿主, 除家豬和野豬外, 其它動物不感染該病毒。發病豬和帶毒豬是非洲豬瘟病毒的主要傳播宿主, 病豬各組織器官、體液、各種分泌物、排泄物中均含有高滴度的病毒, 因此可經病豬的唾液、鼻分泌物、淚液、尿液、糞便、生殖道分泌物以及破潰的皮膚、病豬血液等進行傳播。歐洲野豬比較容易被病毒感染, 表現出的癥狀跟家豬相似, 有三種非洲野豬 (疣豬、大林豬、非洲野豬) 不表現出癥狀, 隱性帶毒, 成為病毒的貯存器。非洲豬瘟病毒是唯一的蟲媒DNA病毒, 軟蜱是主要的傳播媒介和貯存宿主。因此, 在非洲, 非洲豬瘟病毒在蜱和野豬感染圈中長期存在, 難以根除, 并在一定條件下感染家豬, 引起暴發。

  另外, 豬肉及豬肉制品, 被污染的飼料、水源、器具、泔水、工作人員及其服裝以及污染空氣均能成為傳染源, 經口和上呼吸道途徑傳播。

  

  2.2 傳播途徑

  非洲豬瘟的傳播途徑較為廣泛。比如, 直接接觸感染豬 (直接傳播途徑) , 飼喂污染的豬產品、飼料、泔水, 接觸污染的糞便、墊料等 (間接傳播途徑) , 以及蜱媒介傳播。根據俄羅斯相關部門的調查顯示動物及動物產品的移動或接觸、飼喂泔水是主要的傳播方式。

  2.3 流行現狀

  非洲豬瘟于1921年首次發現于非洲的肯尼亞地區, 1957年傳入西歐, 1971年傳入南美洲及中美洲地區, 隨后一段時間內, 疫情較為穩定。2007年以來, 非洲豬瘟在全球多個國家發生、擴散、流行, 根據孫洪濤等人的調查分析, 截止到2015年, 全球約有52個國家發生過非洲豬瘟疫情或檢測到病毒, 其中包括31個非洲國家、17個歐洲國家和4個拉丁美洲國家。根據翁善鋼統計, 2016年共有10個國家的多個地區發生非洲豬瘟疫情, 分別是拉脫維亞, 烏克蘭敖德薩市, 俄羅斯克拉斯諾達爾邊疆區, 南非西北省和自由省, 摩爾多瓦敦杜舍尼區, 波德拉謝省, 立陶宛烏田納縣, 馬里塞古省, 布隆迪恩戈齊, 肯尼亞西部州。

  根據OIE通報, 截止2017年10月底, 全球共有11個國家 (波蘭、拉脫維亞、立陶宛、烏克蘭、俄羅斯、捷克、贊比亞、南非、摩爾多瓦、羅馬尼亞、科特迪瓦) 發生非洲豬瘟疫情。其中波蘭疫情數高達470多起, 拉脫維亞高達220多起, 立陶宛高達210多起, 三個國家疫情多發生于野豬;羅馬尼亞首次發生該疫情, 感染動物為家豬, 感染來源尚不清楚;另外值得注意的是, 自2014年以來, 俄羅斯非洲豬瘟疫情嚴重, 今年又有多個地區發生, 截止目前疫情數高達120多起, 且絕大多數疫情發生于家豬。

 

  2.4、分子流行病學

  ASFV基因組變異頻繁, 表現出明顯的遺傳多樣性。根據ASFV P72蛋白C端編碼基因的序列, 將ASFV分為22個基因型, 即P72基因Ⅰ型到基因Ⅹ, Ⅻ型。如果根據P54和PB602L基因的中央可變區 (CVR) 進行遺傳分析, 可將P72基因分型進一步細化[22]。因此, 研究AS-FV的分子流行病學, 對病原的溯源和防控有著重要意義, 也為病毒的流行病學特征分析提供了新思路和方法。

  2.4.1 ASF在非洲地區的流行現狀

  非洲大陸作為ASF流行的主要區域, 也是ASFV的最早的發源地, 近些年來, 非洲地區每年都有20多個國家出現ASF疫情, 并且多數呈地方性流行。目前, 肯尼亞、莫桑比克、納米比亞、尼日利亞、盧旺達、南非、坦桑尼亞、多哥、烏干達和贊比亞等國家都相繼暴發ASF[23-25]。DAVID等[26]在烏干達的健康生豬血清中, 發現具有較高的ASFV抗體陽性率, 然而, 其發病率較低, 這與烏干達家豬群中流行的是ASFV弱毒株是否有關, 還需進一步調查論證。在塞內加爾, JORI等[27]通過對流行病學和分子分型進行研究發現, 疣豬和O.sonrai蜱不太可能參與ASF的傳播。2008年, 坦桑尼亞暴發ASF疫情, 通過對來自該地區的死亡家豬組織樣品進行分析發現, 坦桑尼亞株 (2008株) 為P72基因型ⅩⅤ, 并與坦桑尼亞株 (2001株) 具有很高的同源性。流行病學調查表明, 活豬的運輸對ASF在坦桑尼亞地區的傳播過程中發揮了積極作用[28]。2011年, 有學者從坦桑尼亞無明顯癥狀的豬樣品中檢測到ASFV的基因組, 進行遺傳分析后發現其與歐洲毒株基因具有很高的相似性, 屬于Ⅰ基因型Ⅱ (即格魯吉亞2007/1株) , 由此推測該病毒可能是從歐洲國家傳入坦桑尼亞, 而非來自其他非洲國家[29]。LUKA等[30]對來自于尼日利亞2007—2011年的樣本中基因Ⅰ型的3個獨立的基因組區域進行分析, 結果發現在P72和P54基因區域沒有變化, P72序列的系統發育樹表明所有的尼日利亞株都屬于基因Ⅰ型;B602L基因分析結果表明四聚體重復數存在一定差異, 這將為ASFV進化流行病學信息提供依據。2011年2月, 埃塞俄比亞首次暴發ASF疫情, 采集埃塞俄比亞家豬的23個組織樣品 (2011—2014年) , 進行ASFV基因組分析, 結果顯示ASFV的部分P72基因序列為1個新的基因型[31]。對2010—2013年暴發于烏干達的ASFV進行遺傳性相關分析, 發現了2個新的CVR亞型, 并且第1次對烏干達不同地域中ASFV的分子流行病學進行詳細評估[32]。

  2.4.2 ASF在高加索和歐洲地區的流行現狀

  2007年4月, 在歐洲地區再次出現ASF疫情, 隨后在5個國家蔓延, 尤其在俄羅斯聯邦及其周邊的格魯吉亞、亞美尼亞、阿塞拜疆等高加索地區流行情況更為嚴峻。由于該地區社會經濟、政治和文化等復雜因素的影響, 特別是缺乏對ASF疫情的協調控制方案, 增加了ASF在該區域傳播的風險, 目前, ASF疫情的擴散對受災國家的經濟造成嚴重影響[33-34]。研究者發現, 在高加索地區和俄羅斯發現的ASFV分離株存在相同的P72, P54和CVR序列, 這表明其來源于同一個ASFV毒株[35]。2007年格魯吉亞出現大范圍的ASF疫情, 隨后在2007—2012年期間, 大量家豬和野豬感染ASFV, 研究發現該病毒的循環模式也許是其一直保持高致病性的重要原因[36]。有學者對長期流行于意大利撒丁島的AS-FV進行變量序列分析, 發現該撒丁島分離毒株的變異性較低, 證實了該地區的毒株存在顯著的遺傳穩定性[37]。2014年1月, 在立陶宛野豬群中首次出現ASF疫情, 隨后GALLARDO等[38]采用2014年流行于歐盟的ASFVⅡ型毒株實驗性感染家豬, 并對病毒學、病毒的水平傳播、產生的臨床癥狀和誘導家豬體液反應情況進行評估研究。2014年, 對流行于立陶宛和波蘭的ASFV進行檢測, 測序結果顯示該毒株與白俄羅斯流行株 (2013年) 相似, 與流行于東歐的毒株同源性為100%, 但與格魯吉亞分離毒株 (2007株) 存在一定差異性[39]。

  3 臨床癥狀及診斷

  3.1 臨床癥狀

  非洲豬瘟病毒自然感染的潛伏期一般為4~19d。非洲野豬對該病有很強的抵抗力, 一般不表現出臨床癥狀, 但家豬和歐洲野豬一旦感染, 則表現出明顯的臨床癥狀。根據病毒的毒力、感染劑量和感染途徑的不同, 臨床癥狀存在差異, 可表現為最急性、急性、亞急性或隱性感染。

  最急性型多發生在非洲地區, 往往無明顯癥狀就突然倒地死亡。急性型表現為食欲減退, 高溫 (達40~42℃) , 擠成一團, 共濟失調, 心跳加快, 呼吸困難, 部分咳嗽, 眼、鼻有漿液性或粘液性膿性分泌物, 皮膚發紺和出血, 偶爾會出現嘔吐和腹瀉, 血液學檢測會出現白細胞和淋巴細胞減少等。臨床癥狀出現后7~10d內發生死亡, 死亡率高, 可達100%。

  亞急性或慢性非洲豬瘟多發生在非洲以外的地區, 表現為妊娠母豬流產, 呼吸改變, 關節腫大, 跛行, 皮膚潰瘍, 消瘦, 病死率低。

  3.2 病理變化

  非洲豬瘟病毒會引起多種病變類型, 這取決于病毒毒株的毒力。急性和亞急性以廣泛性的出血和淋巴組織的壞死為病變特征。在一些慢性或者亞臨床病例中病變很輕或者幾乎不存在病變。

  病變主要發生在脾臟、淋巴結、腎臟、心臟等器官組織上。內臟器官廣泛性出血。脾臟腫大、梗死, 呈暗黑色, 質地脆弱。淋巴結腫大、出血, 暗紅色血腫, 切面呈大理石樣。腎臟表明及皮質有點狀出血。心包中含有猩紅液體, 心內膜及漿膜可見斑點狀出血。

  在急性病例中, 還會出現其他病變, 例如, 腹腔內有漿液性出血性滲出物, 整個消化道黏膜水腫、出血。肝臟和膽囊充血, 膀胱黏膜斑點狀出血。腦膜、脈絡膜、腦組織發生較為嚴重的水腫出血。

  亞急性型感染豬可見淋巴結和腎臟出血, 脾腫大、出血, 肺臟充血、水腫, 有時可見間質性肺炎。

  慢性型感染豬可見肺實變或局灶性干酪樣壞死和鈣化。病程較長者, 大多發生纖維素性心包炎、肺炎以及關節腫大等慢性病變。

  3.3 臨床診斷

  非洲豬瘟的臨床癥狀和病變與豬的其他一些出血性、高度接觸性傳染病很相似, 比如, 豬瘟、高致病性藍耳病、豬丹毒、敗血性沙門氏菌等。因此, 我們很難或者說不能根據臨床癥狀和眼觀病變來判斷是否為非洲豬瘟, 實驗室檢測是診斷該病最可靠、最準確的方法。

 

  3.4 實驗室診斷

  從實驗方法上分, 非洲豬瘟的實驗室診斷主要有酶聯免疫吸附試驗 (ELISA) 、PCR、熒光定量PCR、DNA原位雜交、免疫組織化學檢測、病毒分離、動物接種等多種方法, 另外, 一些新的方法正在被開發和評估, 比如檢測抗原的側流實驗, 膠體金免疫層析試紙條, 檢測抗體的免疫化學發光實驗等等。但到目前為止, 生產實際中, 應用較多的還是Elisa、PCR以及熒光定量PCR等常用方法, 現將這幾種方法進行簡單介紹。

  酶聯免疫吸附試驗 (ELISA) , 即利用抗原抗體進行免疫反應的定性和定量檢測, 其已被廣泛應用于生物醫學領域。一般情況下, 非洲豬瘟病毒進入豬體內, 7d后便可誘導產生較高的Ig G抗體, 當然針對不同蛋白也會出現個別差異, 但不管怎樣, 該方法仍是最為快速、方便的方法。當前, 市面上尚未使用非洲豬瘟相關疫苗, 因此只要抗體檢測陽性, 便可確診為非洲豬瘟病毒感染。劉豐等人便利用法國ID VET公司的非洲豬瘟抗體檢測試劑盒對對黑龍江省18個邊境縣開展了非洲豬瘟的流行病學調查, 結果均為陰性。但非洲豬瘟引起的急性病例中需結合其它檢測方法進行確診, 因為機體可能尚未產生抗體便已死亡。

  PCR, 聚合酶鏈式反應, 是體外擴增基因的一種方法。研究表明, 非洲豬瘟感染8h, 便可從血液中檢測到其核酸物質, 因此, 針對非洲豬瘟病毒保守區域設計引物, 對采集的血液或組織病料等相關物質進行DNA提取, 進行PCR反應, 可對其進行快速準確診斷。熒光定量PCR, 通俗講是PCR的升級版, 其更加敏感、準確。

  3.4.1、 血清學檢測方法

  3.4.1.1 酶聯免疫吸附試驗 (ELISA)

  ELISA應用于血清抗體的檢測, 具有操作方便、特異性較好、靈敏度高的特點, 適用于大批量樣品的檢測, OIE將ELISA作為診斷ASF的首選血清學方法。ASFV含有約150種蛋白, 目前國內外常用作檢測抗原的蛋白有VP73、VP72、P54、P32、P30等。Wardly等[1] (1979) 首次建立了間接ELISA方法檢測ASFV抗體, 具有較好的敏感性和特異性。Pastor等[2] (1990) 分別以ASFV主要結構蛋白VP73和病毒感染的細胞培養物中高特異胞質可溶性抗原 (CS-P) 建立了兩種間接ELISA方法, 兩種方法特異性均較高, 但是CS-P抗原比VP73抗原至少能提前2d檢測出ASFV抗體。Vidal等[3] (1997) 用VP73單抗建立的固相ELISA, 能夠檢測到濃度為0.5μg/m L的VP73抗原和2.3×102pfu/m L的全病毒顆粒。Hutchings等[4] (2006) 比較了用全病毒多抗血清和針對VP73蛋白的單抗進行間接夾心ELISA檢測ASFV, 顯示多抗血清的敏感性高于單抗。Perez等[5] (2006) 以昆蟲細胞表達的P30重組蛋白為包被抗原, 建立了檢測ASFV抗體的間接ELISA方法, 敏感性高, 可用于ASFV特異性抗體的早期檢測。Gallardo等[6] (2009) 利用重組蛋白p K205R、p B602L、p104R和P54建立的ELISA檢測方法具有較高的敏感性和特異性。蔣正軍等[7] (2000) 以桿狀病毒表達的ASFV VP72蛋白為抗原, 研究和組裝了間接ELISA抗體檢測試劑盒, 具有反應體系小、快速、特異等優點, 且比Dot-ELISA方法更加敏感。仇華磊[8] (2006) 采用大腸桿菌表達的GST-VP72融合蛋白為包被抗原, 建立了間接ELISA。朱紅[9] (2007) 成功獲得5株分泌抗ASFV VP72蛋白單克隆抗體的細胞株, 也建立了間接ELISA方法。李秋霞[10] (2010) 以大腸桿菌表達的ASFV p ET32a-VP73L重組蛋白作為包被原, 也建立了間接ELISA方法。曾少靈等[11] (2013) 利用桿狀病毒表達載體在昆蟲細胞中表達的ASFV的VP73重組蛋白作為檢測抗原, 建立了間接ELISA方法。靳雯雯[12] (2014) 以VP73純化蛋白作為包被抗原, 建立了間接ELISA方法, 與商品化的阻斷ELISA相比, 其具有較好的敏感性和特異性。董志珍等[13] (2012) 針對ASFV P54蛋白建立了單克隆抗體競爭法ELISA并構建了檢測試劑盒, 靈敏度高于間接免疫熒光 (IFA) 方法。梁云浩等[14] (2014) 利用Bac-toBac桿狀病毒表達系統表達出的ASFV P54重組蛋白作為檢測抗原建立了間接ELISA方法。鄔旭龍等[15] (2016) 以原核表達的ASFV p K205R蛋白作為包被抗原, 建立了間接ELISA檢測方法。張倩等[16] (2012) 采用瑞典Svanova ASFV間接ELISA抗體檢測試劑盒對遼寧綏靖、內蒙古赤峰、大連東港共計92份豬血清進行了ASFV抗體的檢測, 結果全部為陰性。鄧飛等[17] (2016) 采用西班牙Ingenasa ASFV阻斷ELISA抗體檢測試劑盒對來源于四川省內的92份豬血清進行檢測, 結果表明, 92份血清樣本均為ASFV抗體陰性。

  3.4.1.2 膠體金免疫層析 (GICA) 試紙條

  張鑫宇等[18] (2014) 用原核表達的ASFV P54重組蛋白制備了ASFV抗體快速檢測膠體金試紙條, 通過對ASFV不同感染時期141份豬血清樣品進行比對檢測, 顯示該試紙條在感染早期的符合率高于OIE推薦的ELISA檢測方法。劉波[19] (2014) 也運用原核表達系統和膠體金免疫層析技術, 對ASFV快速檢測試紙條的技術進行了研究。吳海濤[20] (2015) 運用雙抗體夾心法原理純化后的抗ASFV單克隆抗體制備金標抗體, 制備了用于檢測ASFV的膠體金免疫層析試紙條。

  3.4.1.3 其他血清學方法

  熒光抗體試驗 (FAT) 可用于檢測野外可疑豬或實驗室接種豬的脾、淋巴結等組織壓片和冰凍切片中的ASFV抗原。該方法具有快速、經濟、敏感性和特異性高等優點, 但需要專業試驗人員, 同時需要熒光顯微鏡及高質量的熒光標記抗體。因此僅作為ASFV的輔助檢測方法。間接免疫熒光試驗 (IFA) 可用于檢測感染ASFV的豬血清樣品。該方法的優點是當ELISA檢測結果不確定或制備抗原困難或復雜時, 可選用此法。Malmquist等[21] (1960) 提出并建立了血細胞吸附試驗方法, 血細胞吸附是指豬的紅細胞附著在感染ASFV的單核細胞或者巨噬細胞的表面。絕大多數從非洲分離的ASFV毒株以及最初從歐洲國家分離的ASFV毒株均產生豬紅細胞吸附現象。Pan等[22] (1978) 應用免疫過氧化物酶噬斑染色技術, 對接種ASFV的Vero細胞進行檢測, 3d后觀察到噬斑。可對ASFV進行抗原定量分析。此方法快速、特異, 不用借助其他儀器, 肉眼便可觀察結果。Pastor等[23] (1992) 用細胞質可溶性抗原CS-P, 建立了斑點免疫 (DIA) 檢測方法, 敏感性與OIE推薦的ELISA方法相當。Marco等[24] (2007) 建立了免疫組化法, 用來檢測急性感染ASFV豬的扁桃體組織病理學變化, 通過檢測發現, 感染ASFV豬有出血、單核細胞增多現象。免疫組化法是通用的檢測方法之一, 但對于臨床癥狀不明顯的病例, 確診有一定難度, 因此, 該方法僅作為ASFV的輔助檢測方法。

  3.4.2、分子生物學檢測方法

  3.4.2.1 PCR

  PCR具有簡單快速、靈敏度高和特異性強的優點, 是目前ASFV最常用的實驗室檢測方法。Aguero等[25] (2003) 和曾少靈等[26] (2009) 先后根據ASFV VP72基因設計引物, 建立了ASFV的PCR檢測方法, 均具有良好的敏感性和特異性, 可以檢測出極低含量的ASFV, 為ASFV早期感染的快速診斷提供了有效的分子生物學檢測方法。Aguero等[27] (2004) 和張倩[28] (2010) 先后建立了一步法多重RT-PCR方法, 能夠鑒別診斷豬瘟病毒 (Classical Swine Fever Virus, CSFV) 和ASFV, 可以從臨床樣品 (如抗凝全血、細胞培養物和組織) 中檢測到病毒, 這為早期快速、特異性診斷非洲豬瘟和豬瘟提供了可靠的方法。Basto等[29] (2006) 建立了檢測蜱ASFV的套式PCR方法, 敏感性高于OIE推薦的PCR檢測方法。Giammarioli等[30] (2008) 建立了檢測CSFV、ASFV、豬圓環病毒2型 (PCV2) 、豬繁殖與呼吸綜合征病毒 (PRRSV) 和豬細小病毒 (PPV) 5種病毒的多重PCR檢測方法, 可以用于這5種病毒感染的鑒別診斷。崔尚金等[31] (2012) 建立了ASFV的高效納米PCR檢測方法, 該方法采用納米金顆粒作為熱導介子, 提高了PCR反應效率。敏感性試驗表明, 納米PCR是常規PCR檢測技術敏感性的1, 000倍以上, 最低核酸拷貝數檢出量可以達到10個拷貝。采用該方法對黑龍江、吉林和河南3個省份臨床送檢的69份樣品進行檢測, 結果均為陰性, 表明該地區均無ASFV感染情況。

  3.4.2.2 熒光定量PCR

  實時熒光定量PCR比常規PCR具有更高的敏感性和特異性, 可同時快速檢測大批量樣品。King等[32] (2003) 、李維彬等[33] (2007) 、張泉等[34] (2007) 、黃萍等[35] (2010) 、Tignon等[36] (2011) 、李洪利等[37] (2012) 先后根據ASFV VP72基因, 曾少靈等[38] (2010) 根據VP73基因, 董志珍等[39] (2009) 根據P54基因各自設計引物和探針, 建立了Taq Man實時熒光定量PCR方法。Mc Killen等[40] (2007) 建立的實時熒光定量PCR分子信標 (molecular beacon) 技術具有快速、特異性強、靈敏性和準確性高的特點。該檢測方法可快速鑒別PRV、ASFV、PCV2和PPV。郭少平等[41] (2010) 根據ASFV K205R基因序列設計合成引物及Taq Man探針, 建立了基于K205R基因的ASFV實時熒光定量PCR檢測方法。Mc Killen等[42] (2010) 根據9GL基因建立了MGB探針實時熒光定量PCR檢測方法, 最低可以檢測到20拷貝標準DNA。該方法檢測臨床樣品中的ASFV, 敏感性與OIE推薦Taq Man熒光定量PCR方法相當。Fernandez等[43] (2013) 利用通用探針庫建立了ASFV的實時熒光定量PCR方法。陳靜靜等[44] (2012) 建立了雙重熒光定量PCR, 可同時檢測CSFV和ASFV, 只需一步即可完成, 可作為鑒別兩種病毒的診斷方法。王建華等[45] (2016) 根據ASFV CP530R基因和高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒 (HP-PRRSV) NSP2基因為靶序列, 分別設計特異性引物和Taq Man-MGB探針, 建立了一種可同時鑒別檢測ASFV和HP-PRRSV的二重熒光定量RT-PCR方法。

  3.4.2.3 重組酶聚合酶擴增 (RPA) 技術

  RPA是一種可以替代傳統PCR的新型核酸檢測技術, 該方法操作簡單、反應快速、檢測成本低、結果確實可靠, 王建昌等[46] (2016) 基于ASFV VP72基因保守序列設計并合成引物, 建立了ASFV RPA等溫檢測方法, 為ASFV的一線防控提供了一種新的、可靠的技術支持。

  3.4.2.4 線性指數聚合酶鏈式反應 (LATE-PCR) 技術

  LATE-PCR是不對稱PCR的一種形式, 該方法用于檢測組織樣品的病毒, 其敏感性可以達到大約1拷貝的病毒DNA。Ronish等[47] (2011) 基于ASFV VP72基因建立了LATE-PCR方法, 為ASFV的實驗室診斷提供了敏感的檢測方法。

  3.4.2.5 環介導恒溫擴增 (LAMP) 技術

  LAMP技術操作簡單、靈敏、快速, 檢測成本遠低于熒光定量PCR, 且不需要特殊儀器設備, 具有較高的臨床實用性。江彥增等[48] (2009) 、王彩霞等[49] (2010) 、楊吉飛等[50] (2011) 先后根據ASFV VP72基因序列設計引物, 建立了快速檢測ASFV的LAMP方法, 最低檢測限可達10拷貝質粒DNA, 且具有良好的特異性。鄔旭龍[51] (2014) 根據ASFV K205R基因序列設計引物, 建立了LAMP檢測方法。LAMP方法不需要PCR中的變性、退火步驟即可進行靶序列的循環擴增, 不但大大縮短了時間, 且使反應能夠在恒溫條件下進行, 無需特殊儀器設備, 肉眼判讀, 可以滿足基層快速診斷的需要, 非常適合于基層獸醫實驗室和養殖場使用。

  3.4.2.6 探針雜交技術

  張鑫宇等[52] (2011) 針對ASFV VP72基因分別設計合成1條與保守區域互補的5’生物素標記及3’烷巰基修飾短鏈寡核苷酸探針, 并將烷巰基修飾的探針吸附到納米金顆粒上, 制備納米金標記探針, 將PCR擴增產物與生物素探針及納米金標記探針進行雜交, 雜交產物加入吸附鏈霉親和素的酶標板, 利用親和原理, 捕獲雜交產物, 銀染增強法對納米金標記探針進行信號放大, 進而建立了檢測ASFV VP72基因的納米金探針雜交方法。探針雜交技術檢測靈敏度高, 能有效排除PCR檢測過程中的非特異性結果, 省去了瓊脂糖凝膠電泳步驟, 操作簡便、檢測迅速, 在酶標板中可批量反應, 為ASFV核酸檢測方法開辟了新的途徑, 但該方法的建立難度較高、操作較繁瑣, 對試驗人員技術水平要求較高。

  4 風險分析

  根據非洲豬瘟病毒流行特點及當前形勢, 非洲豬瘟傳入我國的風險日益加大, 風險因素主要包括以下幾個方面:

  (1) 非洲豬瘟疫情國家逐年增多, 鄰國俄羅斯疫情嚴峻;

  (2) 我國與多個國家貿易往來頻繁;

  (3) 我國出境及進境游客人數多;

  (4) 我國生豬及豬肉相關制品進口量大;

  (5) 口岸中生活垃圾與各種廢棄物的未安全處理;

  (6) 中俄邊境地區野豬的流動;

  (7) 我國仍以中小規模豬場為主, 且豬場生物安全意識較差;

  (8) 由于價差, 存在非法動物產品貿易等現象;

  (9) 不排除恐怖組織及其它敵對勢力對我國的生物襲擊。

  5 防控措施

  5.1 普及非洲豬瘟相關知識

  加大非洲豬瘟危害的宣傳力度, 引起全民重視。非洲豬瘟一旦傳入我國, 危害巨大, 且必將造成一系列的連鎖反應, 影響人們正常生活。因此, 防范非洲豬瘟傳入我國, 不僅僅是各地方動物疾控中心、各出入境有關部門、獸醫工作者的職責, 更是我們每個人應盡的義務。外出旅游及工作人員, 不去疫情地區, 不從疫情地區攜帶相關豬肉制品進境;個別生豬及豬肉商販, 要做良心買賣, 不進行非法走私買賣活動。

  5.2 加大國家、政府職能

  及時準確掌握貿易國的疫情史和近期疫情狀況, 發布貿易禁令, 嚴禁與疫情國家進行貿易往來;強化監測預警, 開展省級和區域性獸醫實驗室建設, 加大檢疫力度;加強防疫監管, 各邊境省份, 切實落實邊境巡查、檢疫監管、消毒滅源等綜合防控措施;建立邊境疫情防范屏障, 對監測帶內的家豬和野豬群進行采樣監測, 做到“早發現、快報告、速診斷、嚴處置”;加強對往來疫情國家的游客檢疫, 嚴禁游客從疫情國家地區攜帶豬肉制品進境;另外, 積極引導邊境地區養殖戶杜絕散養散放, 發展規模養殖, 實行嚴格的防疫消毒措施, 做好生物安全措施。

  5.3 強化應急準備

  相關部門舉行突發非洲豬瘟疫情演練, 嚴格疫情處置, 一旦發現疫情, 按非洲豬瘟防治技術規范和防控應急預案規范處置。

  5.4 研制安全有效的疫苗

  相關部門可組織進行科研攻關, 致力于非洲豬瘟的疫苗研發, 防患于未然。

  雖然我國歷史上從未發生過非洲豬瘟, 但從全球范圍看, 非洲豬瘟疫情愈發嚴重, 因此, 我們每個人尤其動物檢疫、獸醫相關從業者應齊心協力, 嚴防非洲豬瘟傳入我境。

  5.5、 高度重視, 常抓不懈

  我國雖未發生非洲豬瘟, 但俄羅斯的非洲豬瘟疫情呈現向東部快速蔓延趨勢, 當前防范非洲豬瘟重大動物疫情形勢十分嚴峻。各級政府和獸醫主管部門應當高度重視防范非洲豬瘟重大動物疫情, 由各級人民政府統一領導和指揮突發疫情的應急工作, 定期進行應急突發事件演練, 召開防控專題工作會議。各部門按照各自工作職責明確分工, 切實把防范工作落到實處, 做好應對非洲豬瘟傳入的各種可能。

  5.6、加強巡查, 嚴防不待

  邊境市縣畜牧獸醫局成立邊境地區動物防疫巡查工作領導小組, 負責本地區動物防疫巡查工作的組織、檢查、督導。對距離邊境線5公里和30公里范圍內所轄的村屯畜禽養殖情況進行徹底調查統計, 按要求填寫調查問卷和調查表格, 及時掌握邊境地區動物養殖、免疫、流通、屠宰等各環節, 特別邊境沿線附近鄉 (鎮) 村屯、野生動物頻繁出沒地區等重點區域的風險因素變化, 實施科學的預警預報, 確保做到“早發現、快報告、嚴處置”。

  5.7、構筑免疫隔離帶

  搞好免疫是做好防控工作的重中之重, 提高免疫密度是防止疫情發生最有效的保證。開展動物防疫工作要統一組織、統一時間、統一行動, 逐頭注射、逐戶排查、逐村推進, 不留死角, 按照建立邊境強制免疫保護帶的要求, 距離邊境線30公里范圍內的鄉鎮村屯, 要再加強一次疫苗的免疫注射, 構筑起堅固的防疫屏障。

  5.8、強化督導檢查

  選派業務素質較高、實踐經驗豐富的專業技術人員, 成立重大動物疫病區域督導小組, 負責動物防疫工作的監督檢查, 采取會戰期間蹲點, 平時隨機抽檢的督導方式, 真正深入到基層, 重點檢查指導非洲豬瘟防范和重大動物疫病防控工作, 隨時發現問題隨時解決。同時, 公布防疫監督舉報電話, 落實專人, 24小時接聽群眾舉報, 對舉報情況及時派人到現場調查核實, 將疫情控制在萌芽狀態。

  5.9、加強疫情監測

  采取“日常監測兼顧全面、集中監測突出重點”的原則, 進行口蹄疫、高致病性禽流感、雞新城疫、豬瘟等免疫抗體檢測工作, 準確掌握免疫狀況, 為制定科學合理的免疫程序提供依據。非洲豬瘟監測采用現場調查和采樣檢測相結合的方法, 全年開展兩次流行病學調查及采樣送檢, 按時完成流調和送檢任務, 發現可疑病例, 按照防治技術規范和應急預案進行報告。

  5.10、加強聯防聯控, 形成防控合力

  加強與出入境檢驗檢疫局等部門密切配合, 強化聯防聯控, 保持信息溝通, 及時掌握國內外動物疫情信息, 加強口岸、非口岸通道管理, 組織聯防巡查, 加大查驗、檢疫和消毒力度。嚴厲打擊動物及其產品走私活動, 嚴禁進口非洲豬瘟疫情國家和地區的豬、野豬及相關產品, 堅決防止境外疫情傳入。

  5.11、加大宣傳, 群防群控

  通過廣播、電視、網絡、張貼標語、發放宣傳單、科技趕場等多種形勢, 廣泛宣傳非洲豬瘟防范知識和防控政策, 積極倡導距邊境3公里以內范圍限制飼養畜禽、距邊境3~5公里以內全封閉飼養畜禽, 盡量避免野生動物與家養動物的接觸, 要嚴格防止野生動物越境, 對越境動物實施驅逐, 降低易感動物感染幾率。增強進出境旅客和相關從業人員的防范意識, 營造群防群控的良好氛圍。

  6、疫苗進展

  6.1、滅活疫苗

  傳統病毒疫苗可通過病毒滅活和病毒致弱兩種方法進行制備。滅活疫苗通過物理或化學手段將病原滅活, 使其失去感染能力, 但保留其抗原性。迄今為止, 采用多種傳統方法制備的ASF滅活疫苗均不能對強毒攻擊提供有效的免疫保護[7,8], 包括病毒接種肺泡巨噬細胞以及感染脾組織后勻漿制備的滅活疫苗。雖然用ASF滅活疫苗免疫后可產生高效價的抗體, 但很難檢測到中和抗體的存在。Blome等[9]研究表明, 即使用新型佐劑PolygenTM或Emulsigen (®) -D等與ASFV滅活抗原進行配伍, 免疫動物后能夠誘導產生ASFV特異性抗體, 但仍未能提高疫苗的免疫保護效力。這可能是由于產生的ASFV特異性抗體并不具有中和活性, 提示細胞免疫在ASF疫苗免疫保護中起重要作用。此外, GómezPuertas等[10]研究人員也證實在細胞傳代過程中, 低代次和高代次的ASFV毒株對中和抗體的敏感性存在差異。鑒于現有研究結果, 采用傳統方法研制有效的ASF滅活疫苗困難很大。

  6.2、減毒活疫苗

  根據減毒活疫苗毒株來源不同, 可將ASF減毒活疫苗毒株分為三類:傳代致弱毒株、天然致弱毒株和重組致弱毒株。減毒活疫苗能夠誘導強烈持久的免疫應答, 但生物安全是其使用的主要限制因素。采用分子生物學手段, 可通過基因重組、靶向缺失以及一次性侵染技術來增強減毒活疫苗的安全性。

  6.2.1 傳代致弱毒株

  ASFV可經過豬骨髓來源細胞、Vero和COS-1等細胞系傳代致弱。傳代過程中, ASFV致病力逐漸下降, 同時病毒免疫原性和穩定性也隨之下降。在西班牙和葡萄牙, 使用傳代致弱毒株免疫動物后產生了災難性的后果, 免疫動物呈現出肺炎、流產和死亡等副作用, 在田間多次感染和異源強毒株存在的條件下, 許多免疫動物呈現ASF慢性感染臨床癥狀。因此, 傳代致弱毒株的致病性導致此類疫苗的開發一度受阻。Krug等[11]利用分離株ASFV-G在Vero細胞中進行傳代培養, 隨著傳代次數的增加, ASFV-G在Vero細胞中的復制能力增強, 同時在豬原代巨噬細胞中的復制能力下降, 病毒毒力逐漸衰減, 在傳至第110代時完全喪失。家豬接種完全致弱的ASFV-G毒株后并未獲得相應保護力, 以抵抗母本病毒的攻擊[11], 表明傳代致弱的ASFV安全性較差且很難提供較好免疫保護。

  6.2.2 天然致弱毒株

  采用天然致弱A S F V毒株OURT88/3或NH/P68免疫動物后, 能誘導產生對同源強毒株的攻毒保護, 依據實驗動物和攻毒毒株的不同, 保護率介于66%~100%[12-15]。研究表明, 病毒特異性抗體以及CD8+T細胞在免疫保護中均起重要作用, 且OURT88/3毒株產生的免疫保護與病毒特異性IFN-γ產生細胞呈正相關性。采用NH/P68免疫后, 豬對高毒力ASFV/L60感染抵抗力增強[13]。以OURT88/3免疫并用致病性OURT88/1毒株進行加強免疫后, 可誘導機體產生針對ASFV I型不同分離毒株的交叉保護[12], 表明研制具有交叉保護的ASFV疫苗是可能的。然而, 天然致弱毒株免疫動物后可造成諸多副反應, 包括肺炎、流產、死亡等, 免疫NH/P68毒株后25%~47%的豬呈現慢性感染[13];免疫OURT88/3后可導致發熱、關節腫脹等癥狀[15]。總之, 天然致弱毒株導致的諸多副反應以及存在散毒的可能性等生物安全隱患限制了其在實際生產中的進一步應用。

  6.2.3 重組致弱毒株

  采用分子生物學方法, 敲除病毒功能基因、病毒毒力基因或者免疫抑制基因, 可降低病毒毒力或增加機體對病毒的免疫應答, 研制比傳統弱毒疫苗安全性更好且效力更高的基因工程減毒活疫苗。研究表明, 一些ASFV毒株在缺失單個或多個毒力基因/或免疫抑制基因后, 如TK (K196R) 、9GL (B119L) 、CD2v (EP402R) 、DP148R、NL (DP71L) 、UK (DP96R) 和多基因家族360和505 (MGF 360/505) , 缺失毒株接種宿主毒力減弱且可誘導產生針對同源母本毒株或異源毒株的特異性免疫保護 (表1) [16-19]。ASFV編碼多種蛋白以干擾宿主免疫系統, 已報道的病毒免疫逃逸相關基因包括A238L、A179L、A224L、DP71L、MGF360/505、I329L、K205R、D96R、DP148R、A276R、D96R和EP153R等, 其編碼蛋白抑制宿主細胞Ⅰ型干擾素和ISGs的產生, 調控細胞凋亡、蛋白合成和自噬等多種信號通路[19-23]。由于這些蛋白質可干擾宿主免疫應答, 從ASFV強毒株中缺失上述基因有助于增強宿主免疫應答 (表1) 。

  安全性和有效性是影響ASF弱毒活疫苗田間應用的重要因素, 安全性和有效性與病毒毒株、免疫或感染劑量、病毒接種途徑以及接種動物密切相關。因此, 致弱毒株保護性的強弱、是否有毒力殘留和是否導致持續感染是弱毒活毒株能否成為候選疫苗毒株的重要決定因素。因此, 還需要進一步研究以確定適合的缺失靶基因及其組合, 以研制可誘導保護性免疫反應且沒有相應副作用的ASFV弱毒活疫苗。

  表1 減毒活疫苗研究進展Table 1 Progress towards the development of ASFV live attenuated vaccines

 

  6.3 病毒活載體疫苗

  已有研究表明, 細胞免疫和體液免疫在抗ASFV感染中發揮作用[24-26]。有學者將ASFV保護性抗原重組入腺病毒或痘病毒載體, 以期獲得更好的細胞免疫和CTL反應。Lokhandwala等[27]將ASFV p32、p54、p72和pp62基因分別重組入人腺病毒Ad5載體中進行“雞尾酒”式免疫, 獲得了良好的抗原特異性CTL反應;之后他們又將ASFV A151R、B119L、B602L、EP402RΔPRR、B438L和K205R-A104R共7個ASFV抗原基因, 重組入復制缺陷型腺病毒載體, 通過“雞尾酒”式混合免疫后能夠誘導強烈體液免疫反應和細胞免疫應答[28]。上述研究仍需通過攻毒保護試驗, 進一步驗證病毒活載體疫苗在ASF疫苗開發中的可行性。

  6.4 核酸疫苗

  ASF核酸疫苗的研究剛剛起步, 通過將編碼病毒主要抗原的基因克隆入真核表達載體后, 直接導入機體內, 在宿主細胞內完成轉錄翻譯后產生抗原蛋白, 從而同時激活體液免疫和細胞免疫應答。Argilaguet等將ASFV p72、p30和p54基因克隆入真核表達載體, 制備ASF DNA疫苗, 但該DNA疫苗免疫豬后并不能夠提供攻毒保護[29,30]。同組科研人員將ASFV p30和p54基因與豬白細胞抗原II的特異性抗體單鏈可變區基因在真核表達載體中融合表達;接種ASF DNA疫苗后, 在沒有誘導產生可檢測水平ASFV抗體的情況下, 能夠使部分動物獲得攻毒免疫保護, 表明細胞免疫在ASFV疫苗的免疫中起重要作用[30]。最新研究表明, 根據一個或兩個ASFV抗原構建的DNA疫苗并不能誘導較高免疫保護, 而免疫ASFV基因組DNA質粒表達文庫能夠提供60%的保護力, 說明有待于發掘更多保護性抗原, 以提高核酸疫苗的保護水平[31]。

  6.5 亞單位疫苗

  ASF亞單位疫苗只包含特定的病毒抗原, 需通過合適抗原傳遞系統免疫動物。鑒定可以引起強烈的免疫應答的抗原及其表位, 有助于開發有效的ASFV亞單位疫苗。研究表明, 針對病毒p30蛋白的抗體在細胞水平抑制超過95%的ASFV內化, p72和p54的抗體能夠抑制病毒吸附, 表明這些蛋白在ASFV感染中發揮作用。用重組p30或p54蛋白免疫豬后可以誘導中和抗體的產生, 但不能提供針對急性ASF感染的保護[32];相比之下, 同時免疫p30和p54蛋白或兩種蛋白的嵌合體可以提供部分保護[32,33]。用桿狀病毒表達系統制備的ASFV結構蛋白p72、p30和p54等, 以蛋白復合物作為抗原免疫動物后仍不能提供有效的免疫攻毒保護[32-34], 說明僅僅依靠上述抗原刺激產生的中和抗體很難獲得理想的免疫保護效果。在另一組研究中, Lopera-Madrid等[35]分別以人源293 (HEK) 細胞表達的ASFV B646L (p72) 、E183L (p54) 和O61R (p12) 亞單位抗原, 或者痘苗病毒載體疫苗進行首免和加強免疫, 獲得較好的體液免疫和細胞免疫水平。因此, 需要研究鑒定更多的ASFV保護性抗原、開發新型免疫佐劑以及采用DNA首免蛋白質加強免疫策略, 以提高ASF基因工程亞單位疫苗的免疫效力。

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